一.立柱安装

操作要点：装填前在塔底垫一层吸附棉，防止吸附剂泄漏。

有两种方法加载柱干法和湿法。

（1）干柱装填：硅胶通过漏斗装入柱内，中间不间断，形成滴流，缓慢加入管内。青岛层析硅胶厂家也可以用橡皮槌敲击柱子，使硅胶填充连续、均匀、致密。柱安装完毕后，打开下端活塞，注入洗脱液洗脱，排出柱内空气，保持一定的液位。

（2）柱湿载：将待用洗脱液装入柱内，打开下端活塞，使洗脱液缓慢流出。然后将硅胶缓慢、连续地倒入柱中（或将硅胶与适量洗脱液混合，形成悬浮液，缓慢地加入柱中）。硅胶在重力和洗脱液的作用下可以在柱中自由沉降。在此期间，流出的洗脱液应继续加入柱内，保持一定的液位，直到硅胶完全加入，柱内沉降不再发生变化。然后在硅胶上加一小块滤纸或一点吸水棉。根据样品量，将洗脱液的液位控制在一定的高度。

均质：搅拌成匀浆。加入两倍于干硅胶体积的溶剂，用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱液为石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，则与石油醚混合；如果洗脱液为氯仿/乙醇体系，则与氯仿混合。如果不能搅拌成匀浆，说明溶剂中的水含量过高，特别是乙酸乙酯/丙酮。如果与水不相容要去除分配色谱，必须事先用无水硫酸钠长期干燥。氯仿用无水氯化钙干燥以除去1%的酒精。如果样品对酸敏感，则不能使用氯仿系统通过色谱柱。

2.装载样品

将待分离样品溶于柱载时使用的少量洗脱液中，制备体积小、浓度高的样品溶液，并将样品溶液加入色谱柱硅胶表面。如果样品未溶解在柱载用的洗脱液中，则将样品溶解在挥发性溶剂中，加入适量硅胶（不超过柱中硅胶总量的1/10）并与之充分混合，除去溶剂，将与样品混合的硅胶均匀地添加到柱的顶部（始终保持一定液位的洗脱液），然后覆盖一层硅胶。

装样时注意沿柱内壁缓慢加入，始终保持硅胶上端面平整。进样量为硅胶的1/60～1/30。

三.洗脱

洗脱剂可通过薄层色谱法进行选择。薄层色谱时，Rf值为0.2~0.3的溶剂体系一般采用梯度洗脱。

首先，打开柱下端活塞，保持洗脱液流速为每秒1~2滴。在上端连续加入洗脱剂（加入速度可由分液漏斗控制，与下端流出速度相似）。如果单一溶剂的洗脱效果不好，可以用混合溶剂进行洗涤（一般不超过三种溶剂），通常采用梯度洗脱。洗脱液的洗脱能力由弱变强。

四.收集和处理

洗脱液以相等的比例收集，每个部分的量大约等于使用的硅胶的量。用薄层法对每种洗脱液进行定性检测，并将含有相同组分的洗脱液进行组合。经过浓缩和再结晶，通常可以得到单体组分。如果仍然是几个单体组分的混合物，则单体组分的结晶不易分离出来。需要进一步的色谱分析或通过其他方法进行分离。

注：（1）柱层析比薄层色谱具有更强的分离能力和更好的分离效果，特别是对于结构相似、性质相似、薄层色谱分离困难的组分。

（2）洗涤塔时，不要使用含水的混合溶剂。